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通過 DNGR-1 表達歷史進行遺傳追蹤將樹突狀細胞定義為造血譜系
作者鏈接打開覆蓋面板芭芭拉·U·施拉姆1詹內(nèi)克·范·布里斯韋克1圣地亞哥澤萊奈1保羅·惠特尼1安德魯·菲爾比2蘇菲·E·阿克頓13尼爾·C ·羅杰斯1娜塔莉亞·蒙考特4海梅·J·卡瓦哈爾45卡埃塔諾·雷斯·索薩1
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被引用
Carmen Gerlach、Aude Thiriot、Ulrich H. von Andrian
起源和譜系:樹突狀細胞的譜系追蹤
單元格,第 154 卷,第 4 期,2013 年 8 月 15 日,第 720-722 頁
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強調(diào)
•DNGR-1 標記 DC 前體
•追蹤 DNGR-1 表達歷史定義了常規(guī) DC
•分析揭示了非淋巴組織中以前未被重視的 DC 群體
•DC的個體發(fā)育定義有助于闡明單核吞噬細胞功能
概括
基于細胞形態(tài)、表型或選擇的功能特性,單核吞噬細胞被分類為巨噬細胞或樹突狀細胞 (DC)。然而,這些屬性不是絕對的并且經(jīng)常重疊,導(dǎo)致細胞類型識別困難。為了規(guī)避這個問題,我們描述了一個小鼠模型,以根據(jù)它們從承諾前體的個體遺傳后代來定義 DC。我們表明,小鼠常規(guī) DC 的前體,而不是其他白細胞,以 DNGR-1 的表達為標志。DNGR-1 表達歷史的遺傳追蹤特別標記了傳統(tǒng)上歸屬于DC 譜系的細胞,并且這種限制在炎癥后保持不變。值得注意的是,在某些組織中,以前被認為是單核細胞/巨噬細胞的細胞實際上是 DC 前體的后代。這些研究為 DCs 的命運圖譜提供了體內(nèi)模型,將它們與其他白細胞譜系區(qū)分開來,從而有助于揭示單核吞噬細胞系統(tǒng)的功能復(fù)雜性。
圖形概要
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介紹
樹突狀細胞 (DC) 在免疫調(diào)節(jié)中起關(guān)鍵作用。從以前看,DC 已被鑒定為具有樹突形態(tài)的非淋巴細胞運動細胞,表達高水平的主要組織相容性復(fù)合物II 類分子 (MHCII) 和整合素CD11c ( Geissmann 等人,2010,Hashimoto 等人,2011,Heath 和 Carbone, 2009 年,斯坦曼和伊多亞加,2010 年)。此外,功能標準,包括遷移能力和刺激T 淋巴細胞的能力,通常用于區(qū)分 DC 與其他單核吞噬細胞例如巨噬細胞 (M?s) 和單核細胞( Hashimoto et al., 2011,Milling et al., 2010,Steinman and Idoyaga, 2010)。然而,功能屬性不是離散的細胞特性,表型標記通常在相關(guān)細胞類型之間共享,特別是在感染后或炎癥期間,當它們上調(diào)和下調(diào)時。無法準確區(qū)分 DCs 和 M?s 導(dǎo)致了混亂和爭論,并且難以評估單個單核吞噬細胞亞型是否在免疫系統(tǒng)中具有的功能(Hashimoto 等人,2011 年,Hume,2008 年)。
基因表達分析和個體發(fā)生關(guān)系已被用于細化 DCs 和 M?s 的定義。例如,通過比較基因表達特征和/或證明給定種群的發(fā)展取決于特定的轉(zhuǎn)錄因子、細胞因子、或生長因子(Gautier 等人,2012 年, Geissmann 等人,2010 年, Greter 等人,2012 年, Haniffa 等人,2012 年, Hashimoto 等人,2011 年, Heath 和 Carbone,2009 年, Hildner 等人, 2008 年,梅雷迪思等人,2012a年,Miller et al., 2012 , Persson et al., 2013 , Satpathy et al., 2012 , Satpathy et al., 2011 , Schlitzer et al., 2013 , Schulz et al., 2012 , Tussiwand et al., 2012 )。盡管如此,仍然需要統(tǒng)一 DC 家族并將其確立為獨立的白細胞譜系的總體個體遺傳學(xué)定義(Hashimoto 等人,2011 年)。
缺乏譜系限制標記 (lin) 并表達 CD115(M-CSF 受體)、 CD135 CX 3 CR1 和低水平CD117(c-kit )的小鼠骨髓 (BM) 細胞, 干細胞因子受體) 在體外培養(yǎng)或轉(zhuǎn)移到小鼠體內(nèi)后僅產(chǎn)生 DC, 被稱為常見 DC 前體 (CDP) ( Auffray et al., 2009 , Liu et al., 2009 , Naik et al., 2007 , Onai 等人,2007 年)。CDP 不會離開 BM,但會產(chǎn)生前 DC,它們通過血液遷移到淋巴和非淋巴器官,在那里它們最終分化為常規(guī) DC (cDC),包括兩個主要的 CD11b +和 CD11b– cDC 子集(Ginhoux 等人,2009 年,Liu 等人,2009 年,Naik 等人,2006 年,Naik 等人,2007 年,Onai 等人,2007 年)。相比之下,漿細胞樣 DCs (pDCs) 被認為是獨立于前 DCs 衍生自 CDPs ( Liu et al., 2009 , Naik et al., 2007 , Onai et al., 2007 ),盡管它們的 CDP 起源最近受到質(zhì)疑(Onai 等人,2013 年)。
由于個體發(fā)育是不可變的,CDP 和前 DC 后代的跟蹤應(yīng)允許定義DC 譜系,而不管標記或功能標準如何。這將有助于解決單核吞噬細胞家族內(nèi)的命名問題,并為研究穩(wěn)態(tài)和炎癥或感染后的 DC 動力學(xué)提供系統(tǒng)。在這里,我們報告可以通過 C 型凝集素受體 DNGR-1 的表達在小鼠中定義 cDC 的前體,并描述了表達 DNGR-1 的細胞及其后代的遺傳標記模型,該模型允許對 DC 進行個體遺傳學(xué)定義小鼠的血統(tǒng)。
結(jié)果
DNGR-1 標記 CDP 和 Pre-DC
DNGR-1(也稱為 CLEC9A)在小鼠中由 CD8α +和 CD103 + CD11b - cDCs 高水平表達,而 pDCs 在較低水平表達(Caminschi 等人,2008 年,Poulin 等人,2012 年,Sancho 等人。 , 2008 年)。我們還注意到脾前 DCs 上存在低水平的受體,定義為lin - CD11c + CD43 + CD135 + CD172a低細胞 ( Naik et al., 2006 ),來自野生型,但不是對照 DNGR-1 -缺陷( Clec9a gfp/gfp ) 小鼠 ( Sancho et al., 2009 ; 圖 S1 A 可在線獲?。?。來自 BM 的前 DCs 也表達 DNGR-1(圖 S1 B)。在該器官中,在 lin - CD11c - CD115 +隔室中還發(fā)現(xiàn)了DNGR-1 +細胞,其中包括 M?/DC 前體(MDP;Fogg 等人,2006)和 CDP(圖1A)。然而,DNGR-1 表達與較低水平的CD117相關(guān)(圖1A),這是一種在轉(zhuǎn)移研究中與 CDP 活性相關(guān)的表型(Auffray 等人,2009 年,Naik 等人,2007 年,Onai 等人,2007 年)。事實上,我們發(fā)現(xiàn) CD117 上的單峰 DNGR-1 表達低,但不在 CD117 hi細胞或來自對照Clec9a gfp/gfp BM的 CD117 low細胞上( Sancho 等人,2009)(圖1A 和S1C)。lin - CD11c - DNGR-1 +細胞另外表達 CD135,但不表達 CD127 (IL-7Rα),這是淋巴前體的標志物 ( Schlenner 等人,2010 )(數(shù)據(jù)未顯示),因此表型類似于 CDP。
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圖S1。DNGR-1 專門標記 DC 前體和 DNGR-1 +前體細胞的排序策略和排序后分析,與圖 1相關(guān)
(A) 對 WT 和Clec9a gfp/gfp小鼠的脾單細胞懸液進行譜系 (lin) 標記(Ter119、NK1.1、CD4、CD8、B220、CD11b、MHCII)、CD11c、CD43、CD172a 和 DNGR-1 染色并通過流式細胞儀進行分析。脾前 DC 被鑒定為 lin - CD43 + CD135 + CD172a低細胞。直方圖疊加顯示來自 WT(紅線)和Clec9a gfp/gfp小鼠(黑線)的脾前 DCs 上的 DNGR-1 染色。
(B 和 C) 對來自 WT 和Clec9a gfp/gfp小鼠的BM 單細胞懸液進行譜系標記、CD11c、CD117、CD115 和 DNGR-1 染色,并通過流式細胞術(shù)進行分析。(B) BM 中的前 DC 被鑒定為 lin - CD11c + CD135 +細胞并分析 DNGR-1 表達。與 BM 前 DCs 相比,脾臟上明顯較低的受體表達可能是由于在用于分離脾細胞的消化過程中 DNGR-1 的切割造成的偽影(JvB、BUS 和 CRS,未發(fā)表的數(shù)據(jù))。(C)圖 1 A中確定的 MDP 和 CDP 中 DNGR-1 +細胞的百分比 ( Auffray et al., 2009 , Fogg et al., 2006, Onai et al., 2007 ) 顯示。每個符號代表一只鼠標,水平條代表平均百分比。
(D) 分選策略:使用磁珠富集BM lin -細胞(Ter119、NK1.1、CD4、CD8、B220、MHCII、CD11b 和 CD11c),并對 CD115、CD117 和 DNGR-1 進行染色。Lin - CD115 + DNGR-1 +細胞被分選。DNGR-1 +門通過用同種型匹配的對照抗體染色來定義(右中圖)。數(shù)字表示每個門中細胞的百分比;箭頭表示門控策略。
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圖 1。DNGR-1 標記具有 cDC 受限分化潛能的細胞
(A) Lin - (Ter119、NK1.1、CD4、CD8、B220、CD11b 和 MHCII)、CD11c -來自 WT 的 BM 細胞和Clec9a gfp/gfp小鼠通過流動分析 CD117、CD115 和 DNGR-1細胞術(shù)。上圖: lin - CD11c - CD115 +細胞上的 DNGR-1 和 CD117 表達。底部: lin - CD11c - CD115 + MDP(CD117 hi CD135 +)和 CDP(CD117低CD135 +)上的 DNGR-1 表達。
(B 和 C)將來自 CD45.1 B6.SJL 小鼠的 Lin - CD115 + DNGR-1 +細胞(lin - DNGR-1 +)或總 BM 轉(zhuǎn)移到未照射的 CD45.2 受體中。在第 7 天,分析了 CD45.1 +供體來源的脾細胞的譜系標記 (B) 的表達。(C) 分析 CD45.1 + CD11c + MHCII + cDC 的 CD205 和 CD11b 以識別 CD205 + CD11b - DC 和 CD11b + CD205 - DC。CD11c低MHCII - CD45.1 +分析細胞的譜系標記。數(shù)據(jù)代表三個實驗,每組有兩到三只小鼠。
(D 和 E) CD45.1 + lin - CD115 + DNGR-1 + (lin - DNGR-1 + , n = 5) 或總 BM (n = 6) 細胞被轉(zhuǎn)移到亞致死照射的 CD45.2 受體中。在第 7 天,分析脾 CD45.1 +細胞的 CD11c 和 MHCII (D) 或 CD11c 和 SiglecH (E) 表達。
參見圖 S1。
為了確定 DNGR-1 標記具有 DC 限制潛力的祖細胞,我們從 CD45.1 B6.SJL 小鼠的 BM中分選了 lin - CD115 + DNGR-1 +細胞,無論 CD117 水平如何(圖 S1 D;稱為 lin - DNGR-1 +細胞)并將它們轉(zhuǎn)移到未照射的 CD45.2同類宿主中。對照(未分級)BM 產(chǎn)生多種淋巴和骨髓譜系,包括 B (B220 + MHCII + )、T (CD3 + ) 和 NK (NK1.1 + CD3 - ) 細胞、中性粒細胞/單核細胞 (Gr-1 + CD11b + ) 和 cDCs (CD11c +MHCII + ) (圖 1B和 1C)。相比之下,lin - DNGR-1 +細胞幾乎只產(chǎn)生 CD11c + MHCII + cDC,包括 CD11b -(也稱為 CD8α +,在此通過 CD205 表達確定)和 CD11b +亞群以預(yù)期的比率(圖 1 B 和 1C ; 數(shù)據(jù)未顯示)。
lin - DNGR-1 +細胞的后包括 CD11c低MHCII -細胞。這些細胞缺乏 pDC 標記 Gr-1、B220 或 SiglecH,與 CD11c低MHCII -源自總 BM 的細胞相反(圖 1 C),但表達低水平的 F4/80 和 CD11b(圖 1 C),表明它們可能構(gòu)成前 DC(Naik 等人,2006 年)。與該概念一致,lin - DNGR-1 + BM 細胞僅產(chǎn)生 CD11c + MHCII + 轉(zhuǎn)移到亞致死照射宿主后的 cDC,其中增加的生態(tài)位有利于供體細胞的終末分化(圖1D)。相比之下,對照總 BM 產(chǎn)生了多種細胞類型,包括 pDC(圖1D 和 1E)。因此,在過繼轉(zhuǎn)移中,lin - DNGR-1 +細胞特異性地產(chǎn)生 cDC,但不產(chǎn)生 pDC 或其他淋巴或骨髓細胞,這表明 DNGR-1 標志著 cDC 限制性前體。我們繼續(xù)將 DNGR-1 + CD11c -前體稱為“CDP",盡管我們的數(shù)據(jù)表明該首字母縮寫詞更好地擴展為“常規(guī) DC 前體"(見討論)。
Clec9a -Cre 小鼠允許在 BM 中進行 CDP 的遺傳標記及其在淋巴組織中的后代
我們假設(shè)追蹤 DNGR-1 的表達歷史將使我們能夠確定 CDP 和前 DCs 對單核吞噬細胞系統(tǒng)的個體發(fā)育貢獻。我們通過同源重組產(chǎn)生了在Clec9a基因座控制下表達Cre 重組酶的小鼠(圖 S2 A 和 S2B),并將它們與 Rosa26-stop flox增強型黃色熒光蛋白(YFP)報告小鼠雜交(Srinivas 等人,2001)(以下簡稱稱為Clec9a +/+ Rosa +/EYFP或Clec9a +/cre Rosa +/EYFP小鼠,表明兩個基因座的基因型)。在Clec9a +/cre Rosa +/EYFP小鼠中,預(yù)計 Cre 介導(dǎo)的floxed終止密碼子切除會導(dǎo)致 YFP 的組成型表達,從而不可逆地標記表達 DNGR-1 的細胞及其后代。
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圖 S2。生成Clec9a -Cre 小鼠和門控策略以識別免疫細胞,與圖 2相關(guān)
(A) 顯示了內(nèi)源基因組Clec9a基因座、靶向構(gòu)建體和突變等位基因。用BamHI對基因組基因座進行限制性酶切會產(chǎn)生 13kb 野生型片段,該片段可被 5' Southern Blot探針檢測到。在目標等位基因中,5' 探針檢測到一個 9.3kb 片段。使用跨越 3' 同源臂并產(chǎn)生 2.2kb PCR 產(chǎn)物的 PCR 篩選ES 細胞克隆的靶向性。
(B) ES 細胞中靶向Clec9a等位基因的 Southern Blot 分析。5' 探針用于雜交來自對照和靶向 ES 細胞的 BamHI 消化的基因組 DNA 。
(C) 用于識別淋巴 (C) 和骨髓 (D) 細胞譜系的門控策略。(C) 對來自Clec9a +/cre Rosa +/EYFP的脾消化物的單細胞懸浮液進行染色,以獲得所示的細胞表面標志物。繪圖在活細胞(Dapi 陰性)上預(yù)先設(shè)門,具有白細胞散射分布和低自發(fā)熒光(以排除紅髓 M?)。顯示了 T 細胞 (CD3 + NK1.1 - )、NKT 細胞(CD3 + NK1.1 + )、NK 細胞 (NK1.1 + CD3 - ) 和 B 細胞 (CD19 + CD3 - )上的 YFP 表達。
(D) 分析了具有白細胞散布的活細胞的表面標志物的表達。紅髓 M?s 被鑒定為 F4/80 hi自發(fā)熒光細胞。在剩余的細胞部分中, Ly-6G + CD11b +陽性細胞被鑒定為嗜中性粒細胞。在剩余部分中,CD11b + Gr-1 hi細胞被鑒定為 Ly-6C hi單核細胞,具有高 SSC 和低 FSC 譜的Gr-1低細胞被鑒定為嗜酸性粒細胞。(C, D) 用于識別 YFP 陽性細胞的門設(shè)置在Clec9a +/+ Rosa +/EYFP對照小鼠(未顯示)。
我們首先驗證了Clec9a驅(qū)動的 Cre 在 DC 前體中是活躍的。實際上,在 CDP 和前 DC 中檢測到 YFP,但在Clec9a +/cre Rosa +/EYFP小鼠的 MDP 中未檢測到,如表型所定義(圖2A -2C)。然而,只有一小部分 DC 前體被標記,表明在群體水平上終止密碼子的重組是不完整的(見下文)。盡管如此,我們在Clec9a +/cre Rosa +/EYFP的脾臟中發(fā)現(xiàn)了 YFP +細胞 ,但沒有發(fā)現(xiàn) Clec9a +/+ Rosa +/EYFP小鼠(圖 2 D-2F)。大多數(shù) YFP +脾細胞 是 CD11c + MHCII + cDCs (86.9% ± 4%),而一小部分 (1.7% ± 0.4%) 類似于 F4/80 hi自發(fā)熒光紅髓 M?s。其余的是 CD11c低MHCII低/-并且包括表達 SiglecH、B220 和 Gr-1 的細胞,但不包括類似于 pDC 的 CD11b(圖2D 和 2E)。YFP 信號是細胞自主的,不是由旁觀者攝取 YFP +細胞或細胞碎片引起的,這是通過使用混合 BM 嵌合體確定的(圖 2 G)。圖像分析進一步支持了這一點,顯示 YFP 的均勻細胞溶質(zhì)而不是內(nèi)體定位(圖2H)。YFP +的系統(tǒng)分析脾細胞顯示 B、T、NK 和 NKT 細胞、中性粒細胞或 Ly-6C hi單核細胞的貢獻最小(圖 2 F、S2 C 和 S2D)。沒有觀察到紅細胞或非造血細胞的 YFP 標記(數(shù)據(jù)未顯示)。
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圖 2。Clec9a +/cre Rosa +/EYFP小鼠表現(xiàn)出 DC 限制性 YFP 表達
(A-C)來自Clec9a +/+ Rosa +/EYFP和Clec9a +/cre Rosa +/EYFP小鼠的 BM 流式細胞術(shù)。顯示了 lin - CD11c - CD115 +細胞 (A) 和前 DCs (lin - CD11c + CD135 +,平均百分比 ± SD,n = 6) (B) 上的 YFP 表達。YFP +門設(shè)置在來自Clec9a +/+ Rosa +/EYFP對照小鼠的細胞上(未顯示)。(C) MDP 中 YFP +細胞的百分比 (lin - CD11c - CD115 + CD135 +Clec9a +/cre Rosa +/EYFP小鼠的CD117 hi )、CDPs (lin ? CD11c ? CD115 + CD135 + CD117 low,參見圖 1 A) 和 pre-DCs (lin ? CD11c + CD135 + ) 。
(D-F) Clec9a +/cre Rosa +/EYFP和Clec9a +/+ Rosa +/EYFP小鼠脾臟的流式細胞術(shù)分析。(D) 鑒定并分析活 YFP +細胞是否存在 F4/80 hi自發(fā)熒光(自動)紅髓 M? 和 CD11c + MHCII + cDC。(E) 進一步分析 (D) 中鑒定的 YFP + CD11c低MHCII低/-細胞的 Gr-1、SiglecH 和 B220。(F) 總 YFP +細胞中種群的百分比。(C 和 F)水平條是至少兩次實驗的平均值。
(G 和 H) 用 CD45.1 + B6.SJL 和 CD45.2 + Clec9a +/cre Rosa +/EYFP BM的 1:1 混合物靜脈注射致死性輻照小鼠。6-8 周后分析CD11b +和 CD8α + CD205 +脾 CD11c + MHCII + cDC 的供體 BM 貢獻和 YFP 表達。(H) Image Stream 中的代表性圖像,顯示 CD11c + CD11b +和 CD11c + CD11b中的 YFP 信號-來自Clec9a +/cre Rosa +/EYFP的脾 DC老鼠。明場圖像顯示樹突狀細胞形態(tài)(放大 60 倍)。
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