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Glycotech 合成碳水化合物聚合物和探針

噸在許多情況下，功能性碳水化合物結(jié)構(gòu)的研究需要用報(bào)告基團(tuán)衍生分子以進(jìn)行檢測(cè)，并以具有生物學(xué)意義的多價(jià)形式呈現(xiàn)。以下部分包含合成碳水化合物探針，其中碳水化合物被摻入聚丙烯酰胺基質(zhì)中，從而產(chǎn)生 30kd 多價(jià)聚合物。除非另有說(shuō)明，否則聚合物鏈的大約每 5 個(gè)酰胺基團(tuán)以 4:1 的比例被N 取代，而其他的則以 20:1 的比例含有熒光素。多價(jià)聚合物可與鏈霉親和素報(bào)告試劑一起用于酶免疫測(cè)定、與其他熒光基團(tuán)偶聯(lián)或固定在固體支持物上。在不需要多價(jià)的情況下，也可以使用單價(jià)化探針。在最后一組中，可以使用含有不同摩爾比并因此具有不同碳水化合物基團(tuán)密度的聚合物組。雖然這些探針涵蓋了廣泛的碳水化合物序列，但可根據(jù)要求定制合成特定的碳水化合物聚合物。

Glycotech 平行板流室中的動(dòng)態(tài)流動(dòng)測(cè)定

John T. Patton~GlycoTech Corporation, 羅克維爾, 馬里蘭 20850

F low 測(cè)定允許在明確的壁剪切應(yīng)力下可視化細(xì)胞粘附。細(xì)胞粘附的不同事件的可視化可以通過(guò)選擇性圖像采集和隨后的圖像處理來(lái)量化。流動(dòng)測(cè)定特別適用于研究在比大多數(shù)靜態(tài)粘附測(cè)定更短的時(shí)間尺度內(nèi)非常迅速地發(fā)生的粘附事件。此外，可以研究初始事件之后的事件，例如細(xì)胞穩(wěn)定和擴(kuò)散，從而深入了解特定細(xì)胞-細(xì)胞或細(xì)胞-基質(zhì)粘附行為的動(dòng)力學(xué)。

材料：

顯微鏡：

配置用于相差和熒光操作的倒置顯微鏡

物鏡（6.3 x、10 x、40 x）

舞臺(tái)孵化器

生物：

細(xì)胞懸液（中性粒細(xì)胞、癌細(xì)胞）

35 mm 培養(yǎng)皿中的細(xì)胞單層或涂層基質(zhì)

粘附培養(yǎng)基（不含血清的培養(yǎng)基，含 12 mM Hepes）

纖連蛋白（人血漿）

牛血清白蛋白 (BSA)

流室系統(tǒng)：

帶墊圈和管接頭的流動(dòng)室甲板

35 mm 組織培養(yǎng)皿

哈佛注射泵

安裝在泵上的玻璃注射器（3、5、20 或 60 cc）

硅膠管

旋塞閥

真空泵

電腦/電子：

數(shù)字圖像采集處理系統(tǒng)

顯示器

錄像機(jī)

帶控制器的CCD相機(jī)

時(shí)間日期生成器

具有圖像系統(tǒng)接口的計(jì)算機(jī)

圖像存儲(chǔ)設(shè)備

協(xié)議：

細(xì)胞單層制備

1. 在每個(gè)培養(yǎng)皿中加入 1 ml 5.5µg/ml FN 溶液，用人纖連蛋白 (FN) 涂抹培養(yǎng)皿。

2. 孵育 30 分鐘。在室溫下。

3. 從每個(gè)盤子中吸出溶液。

4.根據(jù)達(dá)到匯合所需的時(shí)間，以0.5-3.0 x 10 5 個(gè)細(xì)胞/ml的接種密度向每個(gè)培養(yǎng)皿中加入 2 ml 細(xì)胞懸浮液（Huvecs、CHO 細(xì)胞） 。

5. 1-5 天后，在流式分析中使用具有融合單層的培養(yǎng)皿。每 2-3 天喂一次細(xì)胞，但通常不是 48 小時(shí)。的流量測(cè)定。

涂層基材制備

1. 用記號(hào)筆在每個(gè)培養(yǎng)皿的中心畫出一個(gè)涂層區(qū)域（直徑 5 毫米），用于涂層基材。

2. 將 20μl 含底物的溶液（濃度為 10μg/ml）加入涂層區(qū)域。孵育 1 小時(shí)。

3. 吸出液體，加入 20µl 1% BSA 封閉 1 小時(shí)。

4. 吸出 BSA，加入 20µl 抑制劑 1 小時(shí)。

5. 培養(yǎng)皿已準(zhǔn)備好用于流式分析。

使用平行板流動(dòng)室進(jìn)行流動(dòng)分析

1. 打開載物臺(tái)培養(yǎng)箱，將粘附介質(zhì)加熱至 37°C 1 小時(shí)。在開始流動(dòng)測(cè)定之前。

2. 組裝將入口、出口和真空管線連接到流動(dòng)室甲板的流動(dòng)系統(tǒng)裝置。用介質(zhì)填充系統(tǒng)并清除系統(tǒng)中的所有空氣。

3. 用細(xì)胞懸液填充入口容器。對(duì)于使用細(xì)胞單層的測(cè)定，建議使用 10 6 個(gè) 細(xì)胞/ml。對(duì)于涂層底物檢測(cè)，使用 10 5 個(gè)細(xì)胞/ml。

4. 將培養(yǎng)皿倒置，將培養(yǎng)皿固定到流動(dòng)室培養(yǎng)皿上，在流路區(qū)域放置一小團(tuán)培養(yǎng)基，然后將 35 mm 培養(yǎng)皿放在培養(yǎng)皿上。真空將盤子放在甲板上。確保盤子附在流動(dòng)路徑中沒(méi)有氣泡。

5. 將組裝好的腔體放在顯微鏡臺(tái)上。

6. 以 0.1-4.0 達(dá)因/cm 2范圍內(nèi)的剪切應(yīng)力啟動(dòng)連接到出口流動(dòng)室的細(xì)胞注射泵流動(dòng)。

7. 讓細(xì)胞流動(dòng)足夠的時(shí)間以獲得足夠數(shù)量的細(xì)胞與細(xì)胞單層或涂層表面相互作用。一般3-10分鐘。用來(lái)。

8. 開始圖像采集。在盤子上的 7-10 個(gè)位置收集圖像。通常，在給定的實(shí)驗(yàn)條件下，3 道菜提供了足夠的數(shù)據(jù)來(lái)顯示處理之間的統(tǒng)計(jì)差異。

9. 在所有培養(yǎng)皿上采集圖像后，進(jìn)行圖像分析以量化流動(dòng)測(cè)定。

參考：

(1) Lawrence, MB, McIntire, LV, Eskin, SK, (1987)，流動(dòng)對(duì)多形核白細(xì)胞/內(nèi)皮細(xì)胞粘附的影響，血液70：1284-1290。

(2) Patton, JT, Menter, DG, Benson, DM, Nicolson, GL, McIntire, LV, (1993)，在平行板室中流動(dòng)的腫瘤細(xì)胞的計(jì)算機(jī)分析以確定它們的粘附穩(wěn)定滯后時(shí)間、細(xì)胞運(yùn)動(dòng)性和細(xì)胞骨架26：88-98。

(3) Jones, DA, Abbassi, O., McIntire, LV, McEver, RP, Smith, CW, (1993)，P-選擇素介導(dǎo)嗜中性粒細(xì)胞在組胺刺激的內(nèi)皮細(xì)胞上滾動(dòng)，生物物理學(xué)雜志65：1560-1569。

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