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我應(yīng)該使用哪種藥物選擇標記？
VectorBuilder在其載體上提供了多種藥物選擇標記，如嘌呤霉素（Puro）、新素（Neo）、潮霉素B（Hygro）和blasticin（Bsd）?？偟膩碚f，我們發(fā)現(xiàn)嘌呤霉素比其他抗生素更快、更穩(wěn)定地殺死非耐藥細胞。因此，我們建議大多數(shù)細胞類型使用Puro。然而，一些細胞類型可能在沒有耐藥性基因的情況下自然對某些抗生素具有一定程度的耐藥性，或者即使有耐藥性基因，它們也對某些抗生素敏感。這些細胞需要測試不同的藥物選擇標記物，以找到最佳的標記物。
常用藥物的推薦濃度和選擇時間
抗生素細胞系推薦濃度推薦持續(xù)時間
嘌呤霉素293T 1-2微克/毫升3-5天
Geneticin（G418）HT1080 500-1000 ug/ml 7-11天
Blasticidin 293T 5-15 ug/ml 7-11天
潮霉素B 293T 100-200微克/毫升5-7天
我們的VectorAcademy文章《增強培養(yǎng)：如何改善細菌生長》為優(yōu)化抗生素濃度以及其他培養(yǎng)條件以提高質(zhì)粒產(chǎn)量提供了指南。
筆記
a.使用Geneticin（G418）來選擇表達新素抗性基因的細胞。
b.頻繁地使細胞傳代可以加速殺細胞素的選擇。
閱讀更多關(guān)于我們的藥物選擇標記物集合的信息
流行的ORF
VectorBuilder提供了許多流行的矢量組件，用戶在設(shè)計矢量時可以從中進行選擇。下表提供了有關(guān)這些流行組件的詳細信息，這些組件按類別單獨列出。
名稱描述應(yīng)用程序說明參考序列
大腸桿菌β-半乳糖苷酶的ORF_Stuffer氨基酸2-83可用作陰性ORF對照。由VectorBuilder設(shè)計
熒光記者
名稱描述應(yīng)用說明顏色結(jié)構(gòu)最大激發(fā)（nm）最大發(fā)射（nm）亮度（EGFP的%）參考序列
EGFP增強型綠色熒光蛋白；基于野生型GFP變體優(yōu)化的密碼子，該變體來自水母維多利亞綠錐蟲常用的綠色熒光蛋白；在所有熒光蛋白中亮度、光穩(wěn)定性和pH穩(wěn)定性都很高。綠色單體（可形成弱二聚體）484 507 100核酸研究24:4592（1996）
NLS-EGFP-EGFP具有核定位信號的兩端核定位。綠色單體（可能形成弱二聚體）484 507 100由VectorBuilder設(shè)計
sfGFP來自維多利亞綠錐蟲的超級折疊綠色熒光蛋白；GFP變體S30R、Y39N、N105T、Y145F、I171V和A20
我什么時候應(yīng)該使用熒光蛋白、螢光素酶或LacZ？
熒光蛋白、熒光素酶和LacZ都是基于重組蛋白的報告子，可用于定位或成像研究。然而，這些系統(tǒng)在幾個重要方面有所不同，這決定了它們適用于不同的實驗設(shè)計。
熒光蛋白和螢光素酶都是發(fā)光的蛋白質(zhì)類型，然后可以用相機或類似設(shè)備檢測到。熒光蛋白的功能是吸收一種顏色的光（激發(fā)），然后發(fā)射不同顏色的低能量光（發(fā)射）。相反，螢光素酶（和其他生物發(fā)光酶）通過催化底物（即螢光素）被氧化的化學(xué)反應(yīng)來產(chǎn)生光，并作為反應(yīng)產(chǎn)物發(fā)射光子。
熒光蛋白比螢光素酶亮得多，螢光素酶有利于許多類型的實驗，但在組織樣本或活體動物中，背景、自發(fā)熒光和光散射
我應(yīng)該使用哪種熒光蛋白？
多年來已經(jīng)開發(fā)了許多熒光蛋白，在實驗中使用哪種熒光蛋白取決于許多因素。
單色實驗
對于單色實驗，綠色FPs是最常見的選擇。EGFP是受歡迎的綠色FP，是許多單色研究的好選擇。然而，其他綠色FP，如TurboGFP（又名maxGFP），可能是某些應(yīng)用的更好選擇。例如，與EGFP相比，TurboGFP具有許多更*的功能，如更亮的綠色熒光、更快的成熟、高pH和光穩(wěn)定性，使其成為受益于早期信號檢測和高靈敏度的實驗的理想選擇。如果首紅色FP，mCherry由于其單體結(jié)構(gòu)、良好的熒光性能和低毒性，是大多數(shù)實驗的佳選擇。它特別適用于蛋白質(zhì)標記或當細胞對可能發(fā)生的毒性或蛋白質(zhì)聚集敏感時
多色實驗
對于同時使用多個熒光團（包括FP和DAPI等其他染料）的多色實驗，研究人員必須仔細考慮熒光團的光譜特性，以確?；诳捎蔑@微鏡、流式細胞儀或熒光檢測中使用的其他硬件上的激發(fā)和/或發(fā)射濾光片，熒光團在光譜上是可區(qū)分的?；旧希瑱z測硬件應(yīng)該能夠在不受其他熒光團干擾的情況下從實驗中使用的多個熒光團中的每一個讀出熒光信號。這可以通過使用激發(fā)濾波器（或激光器）來產(chǎn)生僅激發(fā)感興趣的熒光團的適當頻率的激發(fā)光來實現(xiàn)。也可以通過使用發(fā)射濾波器僅允許來自感興趣的熒光團的發(fā)射熒光進入檢測器來實現(xiàn)。對于兩種顏色，標準的綠色FP（如EGFP）加上標準的紅色FP（如mCherr）
熒光共振能量轉(zhuǎn)移（FRET）
FPs廣泛應(yīng)用于許多基于熒光共振能量轉(zhuǎn)移（FRET）的應(yīng)用中。FRET是一個物理過程，在此過程中，激發(fā)的供體發(fā)色團分子通過非放射性偶極-偶極耦合將能量轉(zhuǎn)移到受體發(fā)色團。在觀察中，FRET導(dǎo)致供體熒光的減少和受體發(fā)射的增加。FRET有幾個先決條件：供體和受體必須非常接近（10-100?）；受體的激發(fā)光譜必須與供體的發(fā)射光譜重疊；供體和受體的躍遷偶極取向必須平行。FRET依賴于距離，并且FRET的效率與供體和受體之間的距離的六次方成反比。因此，它對距離的微小變化非常敏感，使其成為許多應(yīng)用中的強大工具，例如研究DNA或蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)，并進行投資
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